克羅諾桿菌的簡介
克羅諾桿菌（Cronobacter）是一種革蘭氏陰性的無芽孢短小桿菌，屬于腸桿菌科，是一種兼性厭氧的條件性致病菌。在顯微鏡下呈球桿狀或成對排列，有時也可呈短鏈狀，大小為（0.6μm-1.1μm）×（1.2μm-3.0μm），周身鞭毛，有動力，廣泛分布于嬰幼兒配方粉、奶粉、奶酪、水果、蔬菜、肉制品以及自然環(huán)境中。
? ? ? ?克羅諾桿菌曾被認為是產黃色素的陰溝腸桿菌，1980年法默等通過不同菌株之間的DNA雜交、生化、血清等特性，將其正式更名為阪崎腸桿菌，2008年又重新將其定義為克羅諾桿菌屬。該菌屬共包括7個種和3個亞種，即阪崎克羅諾桿菌、蘇黎世克羅諾桿菌、都柏林克羅諾桿菌（含有3個亞種：都柏林克羅諾桿菌都柏林亞種、都柏林克羅諾桿菌洛桑亞種、都柏林克羅諾桿菌乳粉亞種）、穆汀斯克克羅諾桿菌、丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌、康迪蒙提克羅諾桿菌和尤尼沃斯克羅諾桿菌。模式種為阪崎克羅諾桿菌，模式菌株為ATCC 29544。
克羅諾桿菌的檢驗標準的更新
? ? ? ?在2024年2月8日頒布的GB 4789.40-2024版本中，在適用范圍中增加了嬰幼兒輔助食品，即新標準適用于嬰幼兒配方食品、?嬰幼兒輔助食品、 乳及乳制品及其原料中克羅諾桿菌的檢驗。
（圖片來源于GB4789.40-2024）
克羅諾桿菌定性檢驗
1.?前增菌和增菌
? ? ? ?取檢樣100 g(mL) 置無菌容器中, 加入900 mL 已預熱至41℃±1℃?的緩沖蛋白胨水用手緩緩地搖動至充分溶解,36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)18 h±2 h。移取1 mL 轉種于10 mL mLST-Vm 肉湯，41.5℃±1℃培養(yǎng)24 h±2 h。
? ? ? ?由于取樣量較大，如用到剪刀勺子等工具，需提前高壓滅菌，也可以使用無菌的大均質袋來進行前增菌，便于節(jié)省空間。培養(yǎng)時，需防止均質袋翻倒造成液體溢灑及封口不當發(fā)生污染。
BPW預熱至41℃±1℃有助于粉狀樣品充分溶解，也避免了因液體較多升溫較慢引起的增菌失敗。必要時，可拍打均質袋使粉狀樣品充分溶解混勻，BPW相較于無菌生理鹽水等能更好地使受損或缺乏營養(yǎng)的細菌恢復生長。
BPW
? ? ? ? 克羅諾桿菌屬具有較強的耐滲透壓能力和較好的耐熱性，且對萬古霉素天然耐藥，因此使用的改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（mLST-Vm）肉湯在提供了良好營養(yǎng)的條件下利用高濃度的氯化鈉和萬古霉素，且在41.5℃±1℃培養(yǎng)，能有效的抑制革蘭氏陽性菌和其他不耐滲透壓、不耐熱的細菌生長。之前2016版標準中44℃的選擇性增菌溫度，是因為該溫度與ISO 22964-2006相同，但目前國際普遍認為該溫度可能抑制部分受損傷的克羅諾桿菌生長，容易導致污染樣品發(fā)生漏檢。?因此ISO 22964-2017已將選擇性增菌溫度由44 ℃±0.5 ℃修改為41.5 ℃±1 ℃，2024版的新標準也進行了相應的調整。
mLST-Vm
（圖片來源于GB4789.28-2024）
2. 分離
輕輕混勻?mLST-Vm 肉湯培養(yǎng)物, 各取增菌培養(yǎng)物1 環(huán), 分別劃線接種于兩個阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基平板, 36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)24 h±2 h, 或按商品化培養(yǎng)基的要求條件進行培養(yǎng)。
顯色培養(yǎng)基
目前北京陸橋有三款適用于克羅諾桿菌檢驗的顯色培養(yǎng)基。由于標準未規(guī)定產品配方，客戶可根據(jù)需求任選其一。
ESM015 克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基（DFI）：樣品干擾菌少時可選擇。
ESM016 克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基：對樣品中的干擾菌有更好的選擇性和分辨性。
ESM020 克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基（CCI）：ISO22964-2017標準中CCI瓊脂。
ATCC 29544阪崎克羅諾桿菌在三種培養(yǎng)基上的生長情況
樣品分離干擾菌在三種培養(yǎng)基上的生長情況
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?注：CCI在實際表現(xiàn)中與DFI相近
每個平板挑取至少5 個可疑菌落, 不足5個時挑取全部可疑菌落, 劃線接種于 TSA 平板。36?℃ ±1 ℃培養(yǎng)24?h±2?h。
有文獻報道和相關檢測中發(fā)現(xiàn)，部分克羅諾桿菌不產黃色素，因此在新標準中，刪除了黃色素的生化鑒定項目。
3.鑒定
自TSA平板上直接挑取可疑菌落, 進行生化鑒定。克羅諾桿菌屬的主要生化特征見標準中的表3?？蛇x擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)。新標準中，刪除了苦杏仁苷生化項目。
（圖片來源于GB4789.40-2024）
4. 分子生物學檢測
隨著乳制品生產企業(yè)和相關監(jiān)管部門對檢測方法時效性和準確性需求的日益迫切，傳統(tǒng)的檢測方法雖然準確可靠，但操作繁瑣、工作量大、耗時較長，已不能滿足快檢的要求。而分子生物學的檢測方法，由于其具有特異性強、準確性高且快速的優(yōu)勢，近年來被逐漸引入到食品微生物的檢測標準（例如GB 4789.6-2016）中。SN/T 1632.3-2013出口奶粉中阪崎腸桿菌（克羅諾桿菌屬）檢驗方法中就有關于克羅諾桿菌熒光PCR的檢測方法。在新的克羅諾桿菌檢測標準中也增加了PCR鑒定的方法，將其作為選做內容。
? ? ? 北京陸橋的MX-1301克羅諾桿菌屬核酸檢測試劑盒，采用熒光PCR的檢測技術，對克羅諾桿菌屬的特異性基因進行檢測，且含有內標基因，只根據(jù)其擴增曲線即可進行判定，簡便快捷，可根據(jù)需求進行菌液或菌落的鑒定，極大的豐富了克羅諾桿菌的鑒定手段。
克羅諾桿菌屬核酸檢測試劑盒及阪崎克羅諾桿菌熒光PCR結果圖
5.結果與報告
綜合菌落形態(tài)、生化鑒定或PCR鑒定結果, 報告每100 g(mL) 樣品中檢出或未檢出克羅諾桿菌屬。
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